波兰科学院Wojciech M. Kwiatek教授及其团队使用基于光热诱导共振技术(PTIR)的纳米红外光谱(nanoIR)研究了单个染色体中常染色质与异染色质的甲基化差异，实现了非荧光标记的单染色体甲基化分析与常染色质异染色质鉴别，并进一步检测了抗癌药物Pt-103在单个染色体上的定位信息，为抗癌药物的机理研究提供了直观的观察方法。该成果(Infrared nanospectroscopic mapping of a single metaphase chromosome)于2019年7月25日发表在《Nucleic Acids Research》杂志上(Nucleic Acids Res. 2019, 47(18):e108. Doi: 10.1093/nar/gkz630)。

    人类单个染色体中含有常染色质与异染色质两种不同的组分，异染色质通常有着更为强烈的甲基化倾向。DNA的甲基化过程会调控基因的表达，改变DNA的力学性能以及影响DNA与蛋白质或药物等相互作用强度，从而影响细胞的生理活动。DNA的甲基化过程也与癌症的发生有着密切的关系。对染色体甲基化程度与甲基化区域的研究就显得尤为重要。传统的超分辨光学方法需要进行荧光标记，且会因为标记脱靶或荧光猝灭等原因无法完整的反应染色体原本的甲基化区域分布，且无法获知标记区域的化学成分信息。传统的显微红外技术又因其较低的分辨率无法对单个染色体的化学信息分布进行表征。使用基于光热诱导共振技术(PTIR)的AFM-IR技术可以实现具有10 nm分辨率的化学信息的空间分布，是对单个染色体进行化学信息研究的理想手段。作者首先研究了单个染色体高甲基化区域与低甲基化区域的微区红外光谱特征。如图1b所示，染色体的AFM-IR光谱可以显著的看到对应于DNA的特征信号(核酸C=O键振动、环振动以及磷酸根O-P-O振动吸收)，对应于蛋白质的特征吸收信号(Amide I与Amide II特征吸收)，以及对应于核酸甲基化的振动信号，这些信号与使用同步辐射红外光谱(SR-FTIR)对细胞核测得的红外光谱有很好的一致性。使用衰减全反射红外(ATR-FITR)得到的非甲基化DNA光谱不含相应的蛋白质与核酸甲基化信号。进一步对甲基化DNA与非甲基化DNA的红外光谱分析表明，染色体红外光谱中甲基的振动信号主要来源于染色体中DNA的甲基化行为而非染色体中蛋白质的甲基振动。

随后，作者研究了单个染色体中甲基化的空间分布，进而分析了染色体中常染色质与异染色质区域通过甲基化的关系。图2展示了NanoIR对单个染色体进行化学吸收的空间分布分析的结果，1240 cm^-1吸收(磷酸根O-P-O反对称伸缩振动)在染色体中的分布反映了DNA在染色体中分布的情况(图2c)，2952 cm^-1吸收(甲基反对称伸缩振动)在染色体中的分布反映了染色体中DNA甲基化的程度(图2d)。由于DNA红外吸收强烈的区域对应甲基化吸收信号也会增强，导致甲基化的异质性分布不明显。因此，使用1240 cm-1吸收分布对2952 cm^-1吸收分布进行归一化处理，归一化之后的2922 cm^-1/1240 cm^-1信号可以看到明显的条带状结构(图2e)，其中信号较强的区域对应染色体中高度甲基化的异染色质区域。异染色质区域条带状的特征与使用免疫荧光染色方法获得的荧光成像有着很好的一致性(图2f、g)。

作者提取了单个细胞中的一对X染色体进行鉴别，其中一个活性X染色体含有低甲基化常染色质区域和高甲基化的异染色质区域，另一个非活性染色体则几乎全为高度甲基化的异染色质。基于AFM-IR的红外吸收分布可以很好的展示活性X染色体的甲基化异染色质条带状结构(图3b)与非活性X染色体全部高度甲基化异染色质区域(图3e)。AFM-IR在纳米微区采集的化学信号分布得到了免疫荧光成像的验证(图3c、f)。表明AFM-IR技术通可以很好的对单个染色体的化学信息进行获取与分析。

利用AFM-IR可以高分辨获取纳米尺度下化学信息的特点，作者研究了新型抗癌药物Pt-103在染色体上的结合情况。作者提取了Pt-103培养细胞的染色体，使用AFM-IR进行化学分析。Pt-103药物在2916 cm^-1附近有着强烈的红外吸收(图4g)。形貌表征与1240 cm^-1处的吸收分布显示常规培养细胞的染色体(对照组)与Pt-103处理的染色体没有显著差异。在2916 cm^-1处红外吸收分布中，Pt-103处理的染色体有着一个明显的亮点(图4f)，对应药物结合的位置。进一步，在药物结合区域(图4f、g 位置I)与在结合区域附近 (图4f、g 位置II) 采集的红外光谱表现出显著的异质性。药物结合区域有显著的Pt-103相关信号吸收(2916 cm^-1, 2848 cm^-1与1610 cm^-1)，在药物结合区域附近，没有显著的Pt-103的信号吸收。进一步的主成分分析(PCA)表明，Pt-103优先结合于高度甲基化的异染色质区域，体现了AFM-IR技术在药物研发、机理研究等领域有着广阔的应用前景。

该工作使用了Bruker独有的探针共振增强的光热诱导共振技术(PTIR)通过NanoIR系列设备完成。全新的NanoIR3可进行基于接触模式的红外光谱采集与化学信息分布成像，基于Tapping-IR技术可以实现10 nm的化学信息空间分辨率，同样可进行红外光谱采集与化学信息分布成像。为研究者在纳米尺度上提供可解析的高分辨红外光谱信息，为细胞生物学、生物物理学、药物开发与疾病机理等方面的研究提供了强大工具。快速的光谱采集技术可实现秒级的红外吸收光谱采集，HYPERspectra功能可以实现对样品每个像素进行快速光谱采集，为全面了解样品的红外信息提供有力支持。

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